Identificación de clusters de genes pontencialmente involucrados en la biosíntesis de metabolitos secundarios en bacterias de aguadas de calakmul antagónicas a fitopatógenos.

Abstract

La bioprospección de nuevos productos naturales bacterianos útiles para la salud humana, el bienestar animal y la seguridad alimentaria entre otros usos biotecnológicos potenciales, requiere ahora de la exploración de ecosistemas inexplorados como lo es la Biosfera de Calakmul, donde se puede hipotetizar que las bacterias producen metabolitos con importantes funciones ecológicas especialmente de defensa y sobrevivencia. Las herramientas genómicas y bioinformáticas que hoy existen nos proveen con una gran cantidad de datos y capacidad de procesamiento, que permiten abordar los estudios combinando distintos acercamientos, para hacer más eficiente el proceso de descubrimiento de nuevos productos naturales, y orientarlo a objetivos más precisos. Bajo la hipótesis de que la microbiota nativa edáfica de Calakmul, contiene taxas de bacterias no explorados, con clústeres de genes biosintéticos que codifican productos naturales novedosos útiles, para combatir fitopatógenos de cultivos tropicales; en el presente trabajo se planteó como objetivo, identificar clústeres de genes potencialmente relacionados con el fenómeno de antagonismo de las bacterias aisladas de las aguadas en la reserva de la biosfera de Calakmul. Se utilizó un acercamiento guiado por función, donde 225 bacterias aisladas fueron confrontadas con tres fitopatógenos in vitro (Colletotricum gloeosporioides, Fusarium oxysporum y Alternaria alternata). Cien cepas de las 225 evaluadas fueron identificadas como antagonista contra al menos uno de los fitopatógenos mencionados, de las cuales 12 mostraron actividad contra los tres hongos. Estas 12 cepas fueron identificadas molecularmente secuenciando el gen 16S rRNA, más del 50% de ella pertenecen al género Pseudomonas. Para la búsqueda de nuevos clústeres biosintéticos, se secuenció el genoma de las dos cepas bacterianas con mayor capacidad de inhibición a los hongos evaluados. El procesamiento, anotación y la minería de los genomas se llevó a cabo utilizando herramientas como: FastQC, Galaxy, Patric, RAST, AntiSMASH, BiGSCAPE y ANVI’o. A estas cepas se les identificó como Bacillus subtilis CKM138 y Pseudomonas sp. CKM127. Análisis adicionales filogenéticos y de porcentaje de identidad nucleotídico, permitieron identificar que la cepa CKM127 es una especie nueva al que se le asignó el nombre de Pseudomonas calakmulensis. De los dos genomas secuenciados, se logró predecir distintos clústeres biosintéticos. En el aislamiento de B. subtilis CKM138 se predijeron seis clústeres de metabolitos secundarios con menos del 60% de identidad con algún clúster conocido, de los cuales 4 son singletones (no encontrados en ninguno grupo de clústeres reportado en especies cercanas) de acuerdo a BiGSCAPE. Y de la especie nueva identificada, Pseudomonas calakmulensis CKM127, los clústeres de genes biosintéticos predichos no superan 62% de similitud con clústeres conocidos. Seis de ellos tienen menos de 20% de similitud con BGC reportados. Las perspectivas son altamente alentadoras para la realización de estudios de biología molecular y analíticos adicionales para confirmar y elucidar los productos naturales producidos por estas bacterias, y seguir explorando la riqueza microbiológica de la biosfera de Calakmul. _______________ ABSTRACT: The bioprospection of new bacterial natural products useful for human health, animal welfare and food safety, among other potential biotechnological uses, now requires the exploration of unexplored ecosystems such as the Calakmul Biosphere, where it can be hypothesized that bacteria produce metabolites with important ecological functions, especially defense and survival. The genomic and bioinformatic tools that exist nowadays provide us with a large amount of data and processing capacity, which allow studies to be carried out by combining different approaches, to make the process of discovering new natural products more efficient, and to guide it towards more precise objectives. Under the hypothesis that the native edaphic microbiota of Calakmul contains unexplored bacterial taxa, with biosynthetic genes clusters that encode novel natural products effective to combat phytopathogens of tropical crops; In the present work, the objective was to identify clusters of genes potentially related to the phenomenon of antagonism of bacteria isolated from the water holes (aguadas) in the Calakmul biosphere reserve. A function-guided approach was used, where 225 isolated bacteria were confronted with three phytopathogens in vitro (Colletotricum gloeosporioides, Fusarium oxysporum and Alternaria alternata). One hundred strains of the 225 evaluated were identified as antagonistic against at least one of the phytopathogens mentioned, of which 12 showed activity against the three fungi. These 12 strains were molecularly identified by sequencing the 16S rRNA gene, more than 50% of them belong to the Pseudomonas genus. To search for new biosynthetic clusters, the genome of the two bacterial strains with the highest capacity to inhibit the fungi evaluated was sequenced. The processing, annotation and mining of the genomes was carried out using tools such as: FastQC, Galaxy, Patric, RAST, AntiSMASH, BiGSCAPE and ANVI'o. These strains were identified as Bacillus subtilis CKM138 and Pseudomonas sp. CKM127. Additional phylogenetic and nucleotide identity percentage analyzes made it possible to identify strain CKM127 as a new species to which the name Pseudomonas calakmulensis was assigned. From the two sequenced genomes, it was possible to predict different biosynthetic clusters. In the isolation of B. Subtilis CKM138, six clusters of secondary metabolites with less than 60% identity with any known cluster were predicted, of which 4 are singletons (not found in any group of clusters reported in close species) according to BiGSCAPE. And of the newly identified species, Pseudomonas calakmulensis CKM127, predicted biosynthetic gene clusters do not exceed 62% similarity to known clusters. Six of them have less than 20% similarity with reported BGC. The prospects are highly encouraging for additional molecular biology and analytical studies to confirm and elucidate the natural products produced by these bacteria, and to further explore the microbiological richness of the Calakmul biosphere.