Transformación genética de Paulownia elongata mediada por Agrobacterium tumefaciens y por biobalística

Abstract

Se establecieron las condiciones más propicias para transformar genéticamente mediante sistemas directos (biobalística) e indirectos (Agrobacterium tumefaciens), Paulownia elonganta. Se partió desde su propagación in vitro, a través de organogénesis indirecta y directa, encontrando como mejor explante inicial para dicha respuesta segmentos internodales de 0.5 a 1.0 cm de longitud, con una combinación de reguladores de crecimiento de 4 mg L-1 de BA y 0.2 mg L-1 de ANA, generándose 1.33 brotes por explante en promedio. Para la formación de callo a partir de este tipo de tejido el mejor balance fue con TDZ 4 mg L-1, donde más de 80% de explantes forman callo a los 10 días. Se estableció como dosis óptima para el medio de selección 15 mg L-1 de kanamicina. Se pudieron obtener plantas transformadas tanto por transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens, con 2 horas de incubación, 48 horas de co-cultivo y densidad óptica de 0.9; así, como por biobalística, con 120 PSI de presión de disparo a una altura del nivel 6 (16 cm) del sistema y una presión de vacío de 22 mm Hg, usando el sistema de aceleración de partículas de baja presión (PIG). Con los dos sistemas se obtuvieron transformantes confirmados por prueba histoquímica de X-GLUC y por PCR, de ésta última, 14 positivos generados por A. tumefaciens de 26 ensayos y 10 obtenidos por biobalística de 30 ensayos, en ambos casos se usó una construcción que contenía los genes de interés quitinasa y glucanasa, el gen de selección NPT II y el gen reportero GUS. Este es el primer reporte de la integración de los genes quitinasa y glucanasa en P. elongata.__________The most appropriate conditions for genetic transformation through direct (bioballistic) and indirect (Agrobacterium tumefaciens) transformation systems in Paulownia elongata, were stablished. Starting from in vitro propagation through both direct an indirect organogenesis, internodal stem segments with 0.5 to 1.0 cm in length were determined as the best explant for such a response, in combination with growth regulators at doses of 4 mg L-1 BA and 0.2 mg L-1 ANA, resulting in of 1.33 shoots per explant as an average; whereas for callus formation with the same type of explant he best balance was obtained with TDZ 4 mg L-1, producing more than 80% of explants with callus after 10 days. The optimum dose for selection media was determined to be15 mg L-1of kanamycin. It was possible to obtain transgenic plants under both transformation systems. In the case of Agrobacterium tumefaciens, 2 hours of incubation, 48 hours of co-cultivation and optical density of 0.9 were used; while in the biobalistics case, the best conditions were 120 PSI of shot pressure, shot height in level 6 and vaccum of 22 Hg mm, with the particle inflow gun system (PIG). Both systems produced complete transformants as well as chimeras as, confirmed by histochemical analysis X-GLUC and PCR, producing a total of 14 positive plants by A. tumefaciens transformation from 26 trials and 10 posive plants by the biobalistics system from 30 trials; a construction with chitinase and glucanase genes, NPT II selection gene and the GUS reporter gene was used in both systems. This is the first report so far that includes integration of chitinase and glucanase genes into P. elongata.